檢測(cè)項(xiàng)目

蛋白激酶活性檢測(cè)涵蓋以下核心分析維度：

• 基礎(chǔ)活性測(cè)定：通過標(biāo)準(zhǔn)底物磷酸化實(shí)驗(yàn)量化單位時(shí)間內(nèi)ATP消耗量或磷酸化產(chǎn)物生成量
• 動(dòng)力學(xué)參數(shù)解析：計(jì)算米氏常數(shù)（Km）、最大反應(yīng)速率（Vmax）及催化效率（kcat/Km）
• 底物特異性驗(yàn)證：采用多肽陣列或蛋白質(zhì)芯片篩選最優(yōu)反應(yīng)底物
• 調(diào)控因子評(píng)估：測(cè)定抑制劑IC50值、激活劑EC50值及其作用機(jī)制（競(jìng)爭(zhēng)性/非競(jìng)爭(zhēng)性）
• 變構(gòu)效應(yīng)分析：研究金屬離子（Mg?/Mn?）、輔助因子對(duì)酶活性的調(diào)節(jié)作用
• 熱穩(wěn)定性測(cè)試：通過差示掃描熒光法（DSF）測(cè)定酶的熱變性溫度（Tm值）

檢測(cè)范圍

本檢測(cè)體系適用于以下研究場(chǎng)景：

• 基礎(chǔ)研究領(lǐng)域：細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中MAPK、PKA、PKC等關(guān)鍵激酶的調(diào)控機(jī)制研究
• 藥物開發(fā)階段：抗癌藥物靶點(diǎn)如EGFR、ALK、BRAF激酶的抑制劑篩選與優(yōu)化
• 臨床診斷應(yīng)用：腫瘤組織樣本中異常激酶活性水平的定量分析
• 酶工程研究：定向進(jìn)化改造后的突變體激酶功能驗(yàn)證
• 生物標(biāo)志物開發(fā)：疾病相關(guān)激酶活性特征譜的建立與驗(yàn)證
• 交叉學(xué)科研究：納米材料對(duì)激酶活性的影響評(píng)估及生物相容性測(cè)試

檢測(cè)方法

主流檢測(cè)技術(shù)體系包括：

• 放射性同位素法（³²P-ATP標(biāo)記）：通過γ-計(jì)數(shù)器測(cè)量底物中摻入的放射性磷酸基團(tuán)，靈敏度達(dá)pmol級(jí)
• 熒光偏振法（FP）：利用磷酸化底物與熒光抗體結(jié)合后偏振值變化進(jìn)行定量分析
• 時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移（TR-FRET）：采用銪穴狀化合物與XL665熒光受體構(gòu)建雙標(biāo)記檢測(cè)系統(tǒng)
• 發(fā)光法（ADP-Glo?）：通過檢測(cè)ADP生成量間接反映激酶活性，適用于高通量篩選平臺(tái)
• 表面等離子體共振（SPR）：實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)激酶-底物相互作用動(dòng)力學(xué)參數(shù)（ka/kd）
• 質(zhì)譜分析法（LC-MS/MS）：精確鑒定磷酸化位點(diǎn)并定量修飾水平，分辨率達(dá)0.01Da

檢測(cè)儀器

標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室配置包含以下核心設(shè)備：

• 多功能酶標(biāo)儀：配備熒光偏振、TR-FRET、化學(xué)發(fā)光等多重檢測(cè)模塊的SpectraMaxi3x系統(tǒng)
• 微量熱泳動(dòng)儀（MST）：NanoTemperMonolith系列用于分子互作親和力測(cè)定
• 高通量篩選平臺(tái)：整合機(jī)械臂的PerkinElmerJanus自動(dòng)化工作站支持384孔板操作
• 毛細(xì)管電泳系統(tǒng)：LabChipGXII實(shí)現(xiàn)納升級(jí)樣品快速分離與定量分析
• 實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀（RTCA）：xCELLigence系統(tǒng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)激酶活性對(duì)細(xì)胞表型的影響
• 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（UHPLC-MS/MS）：WatersXevoTQ-S系統(tǒng)提供亞飛摩爾級(jí)檢測(cè)限